laporan Biotek tentang PCR

1

LAPORAN PRAKTIKUM

POLYMERASE CHAIN REACTION DAN ELEKTROFORENSIS DNA PADA AGAROSE GEL

Oleh :

Kelompok 3D

1. Ari Firnanda P 151510501105

2. Endang Setyo N 151510501007

3. Dillapia Bayu K 151510501019

4. Nafia Dieta D 151510501046

5. Dwi Tahta Alfina 151510501061

6. Rani Nur Utami 151510501062

7. Lisa Nadia O 151510501119

8. Tic Tic Meilinda 151510501120

9. Eva Tsamrotul A U 151510501225

L A B O R A T O R I U M A G R O T E K N O L O G I

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS JEMBER

2017

BAB 1. PENDAHULUAN

               PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya. Perbanyakan DNA dengan melalui siklus berulang secara berseri yang melibatkan tahap denaturasi, annealing dan extention sehingga dihasilkan fragmen DNA yang di inginkan atau spesifik. Keuntungan yang terdapat dalam PCR yaitu hanya memerlukan DNA target dalam jumlah yang sangat sedikit. Selain itu juga dapat memperbanyak jumlah fragmen DNA yang digunakan untuk mendeteksi suatu gen.

            Tujuan dalam PCR yaitu digunakan untuk membuat fragmen DNA spesifik untuk diinsersikan secara langsung pada vektor. PCR memiliki beberapa tahapan di dalam prosesnya yaitu:

1. Denaturasi, merupakan suatu proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal atau bisa juga dalam tahapan ini ikatan hidrogen DNA template single double strand di putus melalui pemanasan diatas 94 C sehingga DNA menjadi single strand

2. Annealing, merupakan proses penempelan primer. Tahapan ini merupakan tahapan terpenting dalam PCR, karena jika terjadi sedikit saja suatu kesalahan maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan

3. Elongasi/Extention, merupakan suatu proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extention atau sintesis DNA, enzim polymerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Proses pemanjangan primer oleh DNA polymerase terjadi dengan arah 5’ ke 3’

Elektroforesis suatu metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit dalam medan listrik, sebagai pemisah dari suatu sampel protein, asam nukleat, asam amino, dan karbohidrat. Pemisahan protein serum dalam tabung berbentuk u yang diisi dengan buffer.Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam larutanyang mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid gel. Pemisahan ion analit terjadi karena perbedaan dalam mobilitas, perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran, dua analit hanya dapat dipisahkan jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran. Selain itu pemisahan analit dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. Tambahan gel juga berpengaruh terhadap efek pemisahan. Apabila elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya dua rasio ukuran yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam ukuran.

             Elektroforesis gel agarosa dapat digunakan memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 bp dan dijalankan secara horizontal, sdangkan elektrofaresis akrilamis dapat memisahkan 1 bp dan dijalankan secara vertikal. Elektrofaresis poliakrilamid biasaya digunakan untuk mentukan urutan DNA. Pada saat pencampuran DNA dengan loading dye seperti bromphenoil blue dan xylene cyanol FF sebagai visualisasi gel untuk proses migrasi DNA pada saat prosess elektroforesis berlangsung tidak melebihi batas gel. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA, sehingga fragmen DNA yang berkuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar. Faktor selain ukuran molekul DNA yang dapat mempengaruhi laju fragmentasi DNA yakni konsentrasi agarosa, konformasi DNA, Voltase yang digunakan serta keberadaan etidium bromida di dalam gel.

1.2 Tujuan

1. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi DNA menggunakan PCR.

2. Mengetahui perbandingan hasil data elektroforesis yang telah di uji.

4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

      PCR (Polymerase chain reaction) merupakan teknik penggandaan gen target dengan menggunakan primer tertentu. Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA. Denaturasi merupakan proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (templete) sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan singkat pada suhu 90-95°C selama beberapa menit. (Nugroho dan Rahayu, 2017). Rendahnya konsistensi hasil PCR disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya penempelan primer pada cetakan genom DNA yang tidak sempurna disebabkan karena tidak tepatnya konsentrasi komponen-komponen PCR RAPD dan pengaruh kualitas DNA templete. Konsentrasi template DNA berhubungan dengan konsentrasi primer, sehingga perlu dicari optimalisasi rasio antara konsentrasi templete DNA dengan primer (Martida dan Pharmawati, 2016).

Teknik dalam mensintesis DNA dengan menggunakan enzim polimerase bertujuan untuk menggandakan segmen pada DNA. Proses penggandaan DNA disebut dengan Replikasi DNA. Tahapan pada PCR terdiri dari 5 tahapan yaitu, Pra-Denaturasi DNA, Denaturasi DNA, Annealing atau penempelan primer, Polimerasi atau Extention DNA dan Polimerase akhir atau Past Extention (Bangol dkk., 2014). Salah satu tahap pada PCR ialah Annealing atau penempelan atau penempelan primer. Pengaturan suhu pada tahap annealing pada proses PCR sangat berpengaruh pada proses pelekatan primer sehingga perubahan suhu yang tidak sesuai akan menyebabkan primer gagal melekat (Langga dkk., 2012).

Prinsip utama dari Polymerase Chain Reaction adalah DNA yang memiliki sifat spesifik mengalami amplifikasi (dilakukan dengan penggunaan thermalcycler) dan dibantu oleh enzim polymerase untuk melipat ganda. Enzim polimerase berperan dalam penggabungan DNA pada cetakan tunggal untuk pembentukan rantai atau untaian yang panjang dan enzim ini memerlukan bantuan yang biasanya disebut dengan primer. Primer ini berasal dari DNA target yang terdapat dalam rangkaian basa nukleotida. Primer pada PCR bagi menjadi dua

5

yaitu primer forward dan primer reverse, dan berfungsi untuk mengawali rantai DNA dalam melakukan sintesis. DNA pada proses PCR sangat penting karena DNA merupakan bahan utama yang harus ada untuk melakukan proses PCR. Tanpa adanya DNA dalam proses PCR maka hasil tersebut tidak akan diperoleh (Nooratiny et al., 2013)

Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan dan purifikasi fragmen pada DNA, RNA, dan protein. Pemisahan molekul pada fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan muatan listrik. Elektroforesis DNA dipisahkan berdasarkan perbedaan ukurannya. Pemisahan DNA dapat menggunakan gel agarosa yang merupakan polisakarida dari rumput laut. Penggunaan agarosa gel pada elektroforesis merupakan cara yang efektif dan efisien untuk memisahkan fragmen DNA. Pemisahan fragmen DNA menyebabkan fragmen DNA menjadi potongan beberapa fragmen berdasrkan molekulnya (Lee et a.l, 2012).

Elektroforesis gel agarose dilakukan untuk menganaisis hasil amplifikasi, yang berperan sebagai sirkuit elektrik untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan jumlah nukleotida penyusunnya. Semakin kecil ukuran pasang basa nukleotidanya, akan semakin mudah bermigrasi dan berada di bagian gel yang dekat dengan anoda. Pita DNA yang terbentuk diamati dengan alat UV transilluminator dan penentuan ukuran fragmen dilakukan dengan cara membandingkan mobilitas fragmen DNA dengan DNA standar yang telah diketahui ukurannya (Bakri dkk., 2015). Elektroforensis menggunakan hasil DNA yang diproses dengan menggunakan PCR selama 35 siklus yang umumnya menggunakan suhu 94oC selama 2 menit. Kelemahan dari penggunaan elektroforensis gel adalah yaitu kurang efisien dalam masalah waktu karena pelaksanaan membutuhkan waktu yang lam. Selain agarose sangat rumit dan menggunakan bahan-bahan yang sulit diperoleh (Asmarinah et al., 2012).

6

BAB 3. METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Bioteknologi Pertanian dengan acara “Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Elektroforesis DNA pada Agarose Gel” dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 19 Oktober 2017 pukul 12.00 sampai selesai Fakultas Pertanian Universitas Jember.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

1. Mesin PCR

2. Tabung PCR

3. Mikropipet

4. Chamber Elektroforesis

5. UV transiluminator

3.2.2 Bahan

1. DNA template

2. Dntp mix

3. Enzym taq polymerase

4. DNA yang telah dipotong

5. Agarose

6. Loading buffer

7. TBE 1X (Tris-Borate-EDTA)

8. Ethidium bromide

9. Marker DNA

3.3 Pelaksanaan Praktikum

3.3.1 Poymerase Chain Reaction

1. Memasukkan bahan-bahan yang digunakan ke dalam tabung PCR

a. Deionized water steril 31,75 μl

b. Bufer PCR 5μl

7

c. dNTP mix 4μl

d. Primer formard 4μl

e. Primer reverse 4μl

f. Enzim taq polymerase 50μl

2. Mencampur dengan baik, kemudian masukkan tabung PCR ke mesin thermocycle, mengatur program PCR lalu menjalankan programnya.

3. Melakukan elektroforesis hasil PCR pada gel untuk mengetahui keberhasilan PCR setelah selesai PCR.

3.3.2 Elektroforesis DNA Pada Agarose Gel

1. Membuat gel agarose dengan konsentrasi 1% menggunakan pelarut TBE 1X (telah mengandung ethidium bromide).

2. Menambah dengan 3μl loading buffer DNA hasil pemotongan, lalu memasukkan ke dalam sumuran yang terdapat pada gel agarose.

3. Mengaliri alat elektroforesis dengan arus listrik 100 volt selama 30-45 menit.

4. Mencuci gel dengan air, lalu meletakkan diatas uv transluminator, DNA akan berpendar berwarna orange lalu difoto.

3.4 Variabel Pengamatan

Variabel yang diamati meliputi panjang marker dan warna DNA yang berpendar.

3.5 Analisis Data

Analisis data yang digunakan adalah analisis data deskiptif yang mendeskripsikan hasil pengamatan yang telah diperoleh dan mengaitkannya dengan literatur.

8

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Tabel 1. Hasil Pengukuran Kecepatan Fragmen DNA Berdasarkan Berat Molekul Menggunakan Elektroforensis

Gambar

Keterangan

Marker DNA

Hasil Visualisasi DNA

Keterangan hasil visualisasi DNA :

1. Marker

2. Wild type + Gene All

3. Plasmid + Thermo

4. Transforman + Thermo

5. Plamid + Gene All

6. Transforman + Gene All

4.2. Pembahasan

PCR merupakan proses siklus berulang-ulang dalam melakukan penggandaan DNA yang meliputi beberapa tahap, yaitu denaturasi, annealing, dan ekstensi. Proses denaturasi terjadi pemisahan untaian DNA dengan menggunakan temperatur suhu tinggi sekitar 90 hingga 97o C, namun suhu yang paling optimum dilakukan pada suhu 95o C selama 30 detik. Tahap kedua yaitu annealing merupakan proses penempelan DNA primer pada salah satu untaian DNA yang

550

550 Bp

dilakukan pada temperatur suhu 55 hingga 60o C selama 30 detik. Tahap selanjutnya adalah ekstensi atau pemanjangan untai DNA primer yang dibantu enzim polimerasi sebagai pengkode basa nukleotida dalam memasangkan sesuai dengan pasangan basa tersebut. Ekstensi dilakukan pada temperatur suhu 72o C dalam waktu yang tidak pasti karena disesuaikan dengan panjang pendeknya untaian DNA, namun umumnya ekstensi dilakukan dalam waktu 2-3 menit (Feranisa, 2016).

Faktor yang mempengaruhi keberhasilan teknik amplifikasi DNA menggunakan PCR adalah dNTP (deoksiribonukleotida triphosphat), oligonukleotida primer, DNA cetakan (template), komposisi larutan buffer, jumlah siklus saat dilakukan reaksi, enzim yang digunakan, dan teknis pelaksanaan maupun faktor non teknis lainnya. Pengaturan suhu yang tidak tepat merupakan faktor teknis yang dapat mempengaruhi keberhasilan amplifikasi DNA menggunakan PCR karena bila suhu terlalu tinggi dapat menyebabkan gagalnya proses amplifikasi dan apabila suhu terlalu rendah maka DNA yang dihasilkan akan memiliki spesifitas rendah. Sedangkan faktor non teknis dalam pelaksanaan amplifikasi DNA dapat terjadi akibat kontaminasi saat berjalannya kegiatan baik saat proses pencampuran bahan sebelum denaturasi maupun saat dilakukannya proses denaturasi hingga ekstensi. Oleh karena itu kontaminasi dalam jumlah sedikit saja dapat mengakibatkan kesalahan produk amplifikasi (Feranisa, 2016).

Kegiatan praktikum acara 1 dan 2 Bioteknologi membahas tentang PCR dan Elektroforesis. Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan DNA, RNA atau protein. Pemisahan DNA tersebut didasari oleh perbedaan muatan listrik dan berat molekul. Elektroforesis biasanya digunakan untuk pemisahan DNA berdasarkan perbedaan ukuran molekul. Semakin kecil berat molekul, maka kecepatan jalan dari primer akan semakin tinggi. Kegiatan praktikum kali ini menggunakan media gel Agarose. Agarose adalah polisakarida yang diekstrak dari bahan alam untuk pemisahan polimer dalam asam nukleat pada DNA yang akan dipisahkan. Penggunaan konsentrasi yang dipakai pada gel agarose yakni hanya sebesar 1 %. Hal ini disebabkan konsentrasi ini sangat berpengaruh terhadap plasmid . apabila penggunaan tersebut terlalu encer maka akan

10

mengganggu proses pergerakan sehingga proses tersebut menjadi berantakan. Sedangkan apabila penggunaan tersebut terlalu padat maka DNA akan sulit gerak sehingga proses pertumbuhan semakin lambat. Konsep dasar pemisahan DNA diperlukan beberapa bahan-bahan utama yakni dd H2O, master mixs (Gene all and Thermo) serta DNA target (Langga dkk., 2012).

Menurut Langga dkk., (2012) DNA target yang digunakan pada kegiatan praktikum elektroforesis adalah Plasmid, NPT, dan Wild Type. Plasmid adalah DNA template yang diisolasi dari bakteri E. coli. NPT adalah DNA template yang mengandung isolat gen tebu transgenik, sedangkan DNA Wild Type adalah DNA yang belum diinduksi dengan senyawa apapun. Perlakuan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah a.) Wild Type + Geen all b.) Plasmid + Thermo, c.) NPT + Gene all, d.) Plasmid + Gene all, e.) NPT + Thermo. Bahan-bahan tersebut dicampurkan dengan Loading buffer ( TAE : Trist Asetat EDTA). Loading buffer berfungsi untuk melindungi DNA agar tidak rusak. Menurut Pertiwi dkk (2015) Ukuran DNA dari hasil PCR lalu dinilai dengan cara membandingkan dengan penanda (ladder) agar panjang DNA sampel dapat diketahui. Ladder yang biasa digunkan yakni low mass ladder dimana ladder tersebut memiliki panjang antara 100-2000 bp.

Berdasarkan hasil praktikum, diperoleh 6 sumur agar yang terdiri dari 5 perlakuan dengan panjang 550 bp dan 1 marker sepanjang 10.000 bp. Marker adalah satuan pengukur yang digunakan sebagai garis pembatas dalam sumur agar. Primer-primer PCR telah mengamplifikasi DNA yang diduga mengandung gen NPT dari tanaman tebu transgenik. Hasil amplifikasi tersebut menghasilkan 4 sumur agar yang berpendar. Perlakuan pertama, Wild Type + Gene all tidak menunjukkan adanya pendar atau cahaya. Hal ini karena gen tersebut sama sekali tidak disisipi oleh gen lain seperti E. coli dan tebu transgenik. Ketika tidak ada gen yang diinduksikan, maka proses anneling tidak dapat berjalan dengan lancar. Langga dkk (2012) menjelaskan bahwa salah satu faktor yang menyebabkan DNA tidak berpendar adalah kemurnian dan konsentrasi DNA cetakan, adanya kompetisi antar cetakan DNA, dan konsentrasi cetakan DNA yang terlalu kecil.

11

Perlakuan selanjutnya adalah dengan menggunakan Plasmid + Thermo, Plasmid + Gene All, NTP + Thermo, dan NTP + Gene all. Hasil dari pembacaan DNA menunjukkan bahwa keempat perlakuan tersebut menghasilkan cahaya berpendar. Gen yang paling banyak memancarkan pendar adalah pada perlakuan antara NPT dengan Gene all dan NPT dengan Thermo. Hal ini berindikasi bahwa pada kedua perlakuan tersebut, terdapat gen dNPT paling banyak sehingga cahaya pendar yang dikeluarkan pun juga sangat terang (Langga dkk, 2012). Pada perlakuan 2 (Plasmid + Thermo) dan perlakuan 4 ( Plasmid + Geneall) diperoleh hasil yang sama yakni memiliki ketebalan pita pola yang sama. Sedangkan pada perlakuan 3 (trans + thermo) dan 5 (trans + geneall) memiliki pita pola yang sama meskipun pita pola sangat tipis. Keberhasilan yang dihasilkan dari proses amplifikasi DNA melalui PCR dan proses visualisasi dengan elektroforesis dibutuhkan DNA yang memiliki kualitas baik sehingga dapat digunakan dengan sesuai ( Putra dkk., 2013)

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan pada bab sebelumnya daat ditarik beberapakesimpulan sebagai berikut :

1. Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi keberhasilan teknik amplifikasi DNA menggunakan PCR, yaitu dNTP (deoksiribonukleotida triphosphat), oligonukleotida primer, DNA cetakan (template), komposisi larutan buffer, jumlah siklus saat dilakukan reaksi, enzim yang digunakan, faktor teknis, dan faktor non teknis.

2. DNA Template yang paling banyak berpendar adalah DNA NTP sepanjang 550 db karena pada NTP terdapat gen dNTP paling banyak sehingga proses anneling dan amplifikasi DNA bekerja dengan baik.

3. Gen dNTP dan media agarose memberikan pengaruh besar terhadap keberhasilan proses elektroforesis, semakin banyak gen dNTP maka cahaya pendar yang dihasilkan oleh DNA primer akan semakin besar dan semakin

12

baik media agarose yang diberikan, maka proses elektroforesis akan semakin cepat.

5.2. Saran

Keterbatasan waktu dan alat membuat kurang efisiennya kegiatan praktikum. Sebaiknya untuk praktikum selanjutnya alat dan bahan disediakan lebih agar demo dapat dilaksanakan di dua tempat sehingga semua praktikan dapat melihat langsung tanpa harus berdesakan dengan praktikan lainnya.

13

DAFTAR PUSTAKA

Asmarinah., Bachtiar, E.W., Malik, A., and Rahayu, S. 2012. Establishment of Human Sperm-Specific Voltage-Dependent Anion Channel 3 Recombinant Vector for the Production of Male Contraceptive Vaccine. Med J Indones, 21(2): 61-65.

Bakri, Z., Hatta, M., Massi, M.N. 2015. Deteksi Keberadaan Bakteri Escherichia Coli O157:H7 Pada Feses Penderita Diare Dengan Metode Kultur Dan Pcr. Kesehatan, 5(2) : 184 – 192.

Bangola, I., Momuat, L.I., dan Kumaunang, M. 2014. Barcode DNA Tumbuhan Pangi (Pangium edule R.) berdasarkan Gen matK. Mipa Unsrat Online, 3(2): 113-119.

Feranisa, Anggun. 2016. Komparasi antara Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) dalam Diagnosis Molekuler. Dental, 3(2): 145-151.

Langga, I.F., Restu, M., dan Kuswinanti, T. 2012. Optimalisasi Suhu dan Lama Inkubasi dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw) serta Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik Rapd-Pcr. Sains & Teknologi, 12(3): 265-276.

Lee, P.Y., Costumbrado, J., Hsu, C., dan Kim, Y.H. 2012. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Visualized Experiments, (62): 1-5.

Martida, V dan Pharmawati, M. 2016. Pemilihan Primer Rapd (Random Amplified Polymorphic DNA) Pada PCR (Polymerase Chain Reaction) Tanaman Kamboja (Plumeria sp.). Simbiosis, 4(1): 16-18.

Nooratiny, I., Sahilah, A. M., Alfie, A.R.A., dan. Farouk, M. M. Y. 2013. DNA Extraction from Ghee and Beef Species Identification Using Polymerase Chain Reaction (PCR) Assay. International Food Research, 20(5): 2959-2961.

Nugroho, E.D dan Rahayu, D.A. 2017. Pengantar Bioteknologi. Yogyakarta: Budiutama.

Pertiwi, N.P.I., Mahrdika, G. N., Wataniasih, L. 2015. Optimasi Amplifikasi Dna Menggunakan Metode Pcr (Polymerase Chain Reaction) pada Ikan Karang Anggota Famili Pseudochromidae (Dottyback) Untuk Identifikasi Spesies Secara Molekular. Biologi. 19(2): 1-5.

14

Putra, G. P. D., Adiartayasa, W., dan Sritamin, M. 2013. Aplikasi Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Terhadap Variasi Gejala Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) pada Beberapa Jenis Daun Tanaman Jeruk. Agroteknologi Tropika, 2(2): 82-91.

15

LAMPIRAN

Gambar 1. Memasukkan ddH2O pada PCR cup dan diulang

sebanyak 5 kali sesuai sampel yang digunakan

Gambar 2. Menutup PCR cup yang telah di isi ddH2O

Gambar 3. Memasukkan bufer PCR

16